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PCR 技术在食品检测领域的国内标准使用现状及应用进展论文

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  关键词:PCR;致病菌;动物检疫;转基因食品检测;物种鉴定;过敏原检测

  PCR技术,即聚合酶链式反应技术,是体外扩增DNA序列的检测技术。PCR技术使微量核酸(DNA或RNA)扩增操作变得简单易行,还可使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发展可分为三个阶段,最初发明的常规PCR被称为第一代PCR;实时荧光定量PCR被称为第二代PCR;微滴数字PCR被称为第三代PCR。PCR技术始于1983年,由Kary Mullis首先合成了Klenow片段;1988年,耐高温的Taq DNA聚合酶被发现,PCR技术由此进入快速发展阶段[1]。经过30余年的发展,PCR技术日趋完善,并逐步被应用于食品检测领域的致病菌检测、转基因食品检测、动物检疫、物种鉴定、过敏原检测、食品工业化生产过程控制等领域中。

PCR 技术在食品检测领域的国内标准使用现状及应用进展论文

  1国内标准使用现状

  笔者收集了国内PCR检测技术在食品领域应用的五百多份标准检测案例。按照其技术特点进行分类,主要包括普通PCR法、实时荧光PCR、PCR-DHPLC、PCR试纸、数字PCR、PCR-CRISPR、巢式PCR(nPCR)和RT-nPCR等类型。

  1.1普通PCR法

  普通PCR法是通过对PCR扩增产物进行电泳检测,并结合凝胶成像分析技术,对目标DNA进行定性检测的一种技术。这项技术被广泛应用于转基因食品的定性检测方面,如农业农村部公告第111号-5-2018,抗虫水稻T2A-1及其衍生品种定性PCR方法。

  1.2实时荧光PCR法

  实时荧光PCR法,是基于荧光标记探针的设计,通过荧光信号的累积与PCR产物间的同步,对目标产物进行定性或定量检测的一种技术。该方法被广泛运用于转基因动植物成分的检测,如GB/T 25165-2010,实时荧光PCR法就是一种测定明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法。

  1.3 PCR-DHPLC

  PCR-DHPLC是基于反相液相色谱原理,利用离子对PCR扩增产物进行分离检测的方法。在该方法下,不同待测物质会显示出独特的DHPLC吸收峰,能够快速检测食品中的致病菌,如SN/T 2641-2010,PCR-DHPLC法可以对沙门氏菌等30种致病菌进行快速检测。

  1.4 PCR试纸

  PCR试纸法基于含有金标记的抗FITC的单克隆抗体和固定含有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条的设计,是对食源性致病菌进行快速定性检测的方法。例如,SN/T 5439.1~7-2022,PCR-试纸条法被广泛用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、克罗诺杆菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌0157、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌等的检测。

  1.5数字PCR

  数字PCR是在荧光PCR的基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术,被用于测定核酸模板的绝对拷贝数。实践中,该方法被广泛应用于食源性病毒检测、致病菌检测以及转基因定量检测。例如,SN/T5325.1~7-2020,数字PCR法常被应用于诺如病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒的检测;SN/T5364.1~8-2021,微滴式数字PCR法被应用于副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌、克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测;SN/T4853.1~7-2017,数字PCR法被应用于转基因大米的定量检测。

  1.6 PCR-CRISPR

  PCR-CRISPR法是通过普通PCR对目标基因进行特异性扩增,并利用CRISPR反应特异性切割扩增产物,进而观测荧光值增量结果的方法。如SN/T1632.4-2022,PCR-CRISPR法是测定出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测方法。

  1.7巢式PCR(nPCR)

  巢式PCR(nPCR)是一种PCR改良模式,利用两对嵌套引物进行两次PCR扩增,并通过多轮扩增进一步提高反应的特异性与灵敏度。对于常规PCR所难以扩增出的样品,可以尝试用巢式PCR进行扩增与检测。如DB37/T 3673-2019就建立了巢式PCR法,用于测定牡蛎中的疱疹病毒。

  1.8 RT-nPCR

  RT-nPCR(reverse transcriptase nPCR),即反转录巢式PCR,常用于拷贝数较低的RNA扩增,主要被应用于病毒检测领域,如GB/T36875-2018猪瘟病毒RT-nPCR的检测。

  2食品检测领域的应用

  2.1食源性病毒和致病菌的检测

  目前,国内已有PCR技术被应用于食品检测领域食源性病毒、致病菌检测定性、定量及快检的标准制定等方面。商品化的病毒RNA和细菌DNA提取和纯化的试剂盒使病毒和细菌的检测变得更安全、便捷、高效。周杨等根据GB4789.6-2016中PCR确证试验要求,采用冻干工艺构建了针对致泻大肠埃希氏菌的干粉化多重PCR检测试剂盒,并通过系列试验评价了该试剂盒的应用实效性。

  2.2动物检疫

  作为初级农产品的各种肉类产品,是人们餐桌上必不可少的美味佳肴。按照动物检疫相关法规规定,肉类产品必须在动物检疫合格后,方可流入市场。当前PCR检测技术已成为检测非洲猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎等病毒的重要检测手段。贾云飞等基于非洲猪瘟病毒中国流行株的P72基因,创建了非洲猪瘟病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法。

  2.3过敏原的检测

  现行有效的国家标准GB7718-2011《预包装食品标签通则》4.4规定,对于8类致敏物质,要求在食品配料表中将其进行推荐性标示。2019年12月31日,国家卫生健康委员会公开发布了包括GB7718在内的13项标准征求意见稿,并向社会公开征求意见。公开意见附录E致敏物质在食品标签中的标示形式要求,原2011版推荐性标示的内容变为强制性标示要求。SN/T1961系列方法提出了利用实时荧光PCR法测定食品中过敏原成分的检测方法。随着国民生活水平的提高,其对食品安全的关注度也在逐步提高,越来越多的食品标签对过敏原成分进行了主动标识。RaquelMadrid等通过对100个样品进行检测,证实了使用实时荧光PCR法检测样品中的致敏成分是最为有效的。

  2.4转基因食品的检测

  农业农村部、海关总署及国家标准化管理委员会均发布了关于转基因成分的检测方法,且多被用于转基因玉米、大豆、大米、蜂蜜、调味品等产品中转基因成分的检测。转基因技术在解决全球粮食问题方面发挥着关键作用。然而,世界各国在对转基因食品安全性的认知以及转基因标识制度的建立等方面并未达成共识。目前,我国转基因大豆仅允许用于加工领域,尚未批准直接以食品形行流向市场。罗明迪等采集海市各区不同品牌的大豆样品29份和豆腐样品12份,通过三对外源基因的特异性引物对所有样品基因组的DNA进行了扩增,在所有样品中均未检出外源基因片段。焦悦等[6]探讨了构建并完善我国转基因产品标识制度和转基因低水平混杂(LLP)阈值制度的重要性,并提出以我国定量PCR检测极限值0.1%为基础,全面开展转基因成分的定量化检测与检验标准制定工作。2023年10月17日,农业农村部公开征求对《农业农村部关于修改农业转基因生物标识管理办法的决定(征求意见稿)》的意见。其中有一项新规定,即“单一作物转基因成分含量超过产品3%时应当标识”。该规定标志着我国对转基因食品的标识可能会从“定性”转向“定量”,并同时规定了3%的阈值。届时,定量PCR将发挥重要的技术支撑作用。

  2.5物种鉴定

  对于畜肉产品中动物源性成分的鉴定,在食品掺杂掺假的检测中应用广泛。另外,依据《婴幼儿配方乳粉产品配方注册管理办法》的规定,若产品名称中包含动物性来源,则应当根据产品配方,在配料表中如实标明其所使用的生乳、乳粉、乳清(蛋白)粉等乳制品原料的动物性来源;在使用的乳制品原料中包含两种及以上的动物性来源时,应当标明各种动物性来源原料的占比。侯艳梅等[7]采用快速、简便、灵敏的Real-Time PCR方法,对样品的乳源进行了初筛,并对检出牛基因成分的配方乳粉增加了双向电泳乳源蛋白检测,进一步判定样品中是掺杂了牛乳还是牛乳清;Malcolm Burns等[8]运用Real-Time PCR法,建立并验证了牛肉样品中马肉和猪肉含量的测定方法。

  2.6食品工业中的应用

  发酵是食品工业化生产中一个非常关键的工艺步骤。微生物菌群利用原料进行代谢,产生了各种风味物质,并被广泛应用于食品工业生产中。许多研究者都对传统发酵食品中微生物菌群及其风味的形成展开了研究和分析。在该研究过程中,PCR检测技术为其提供了重要技术支撑。许随根等[9]应用多重PCR快速鉴定了自然发酵肉制品中的6种葡萄球菌;张媛等[10]采用实时荧光定量PCR法,检测了白酒酿造系统的重要功能菌株Lactobacillus jinshani;张雅伦等[11]建立了用微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的方法。

  3食品检测领域的应用展望

  3.1存在的问题

  PCR技术在食品检测领域已经取得了一定的进展,但其运用范围仍较为有限。影响其广泛应用的因素主要体现在以下几方面,第一,标准体系尚未完善。目前发布的国内标准,主要为行业标准、地方标准和团体标准,以国家标准或国家推荐性标准发布的方法极少,一定程度上限制了该类方法的应用。第二,检测中用到的商品化提取和纯化的试剂盒,大多为进口产品,价格较贵且货期不能得到有效保障。第三,其在病毒和致病菌检测方面虽具备一定的优势,但是假阳性或假阴性情况时有发生,对其结果的可靠性提出了挑战。

  3.2前景展望

  食品安全对于人类生产生活有着至关重要的影响,而食品检测技术为食品安全提供了强有力的技术支撑。PCR技术在食品检测中的应用,与理化分析、光谱、色谱、质谱及经典微生物检测方法相比,具有操作方便、成本低、安全性高、效率高等优势。其相关应用研究虽起步较晚,但随着技术手段的不断成熟,PCR技术必将成为食品检测领域不可或缺的检测手段。

  参考文献

  [1]王恒樑.PCR最新技术原理、方法及应用(第三版)[M].北京:化学工业出版社,2021.

  [2]周杨,万强,蔡芷荷,等.3种致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒的研制与效用评价[J].现代食品科技,2020,36(12):243-251.

  [3]贾云飞,赵福杰,朱静静,等.非洲猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].河南农业大学学报,2020,54(1):69-73.

  [4]RAQUEL MADRID,AINA GARCfA-GARCfA,PABLO CABRERA,et al.Survey of commercial food products for detection of walnut(Juglans regia)by two ELISA methods and realtime PCR[J].Foods,2021,10:440.

  [5]罗明迪,王若秋,张文驹.上海市大豆及豆腐转基因成分检测[J].大豆科技,2021,2:14-20.

  [6]焦悦,王智,张振民,等.基于转基因产品成分低水平混杂问题探究我国转基因阈值制度[J].中国农业科技导报,2022,24(3):20-27.

  [7]侯艳梅,杨艳歌,吴桐,等.Real-time PCR和双向电泳联合鉴别婴幼儿配方羊乳粉的乳源成分[J].食品科学,2022,43(8):324-333.

  [8]MALCOLM BURNS,GAVIN NIXON.Validation of Two Real-Time PCR Approaches for the Relative Quantitation of Pork and Horse DNA in Food Samples[J].Food and Nutrition Sciences,2022,13:387-403.

  [9]许随根,陈曦,李家鹏,等.应用多重PCR快速鉴定自然发酵肉制品中6种葡萄球菌[J].食品科学,2018,39(24):303-310.

  [10]张媛,廖卫芳,缪礼鸿,等.采用实时荧光定量PC R法检测白酒酿造系统中的重要功能菌Lactobacillus jinshani[J].食品与发酵工业,2022,48(6):270-275.

  [11]张雅伦,王赞,张瑞,等.微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌[J].乳业科学与技术,2023,46(2):13-17.

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