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基于响应面法优化唾液乳杆菌高密度培养基论文

理工论文 17℃ 0
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  关键词:唾液乳杆菌;响应面分析;Box-Bohnkon Design

  唾液乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)是一类 益生乳酸菌,大多可以从人和动物的胃肠道及口腔 中获得[1]。作为一种典型的益生菌,唾液乳杆菌可产 生细菌素来抑制病原菌生长[2]。良好的耐受性和黏 附性可使其定植于宿主体内并发挥作用[3]。其可以 调节机体的免疫反应,维护宿主的健康[4]。此外,唾 液乳杆菌还可作为商业发酵剂应用于食品及工业生 产领域。

基于响应面法优化唾液乳杆菌高密度培养基论文

  唾液乳杆菌虽然具有重要的应用价值,但较高 的生产成本和不理想的生物量一直制约着唾液乳杆 菌的高效制备,高密度发酵对其实现产业化应用至 关重要。本实验室分离得到了一株具有多种益生功 能的唾液乳杆菌 AR809[5-6],以其为研究目标,通过 单因素实验及响应面优化来改良发酵培养基,获得 了更高的生物量,为唾液乳杆菌的高密度培养提供 了理论基础。

  1  材料与方法

  1.1  材料与试剂

  1.1.1  菌株

  唾液乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)AR809 保藏于上海食品微生物工程技术研究中心,保藏编 号 CGMCC17202。

  1.1.2  培养基

  MRS 培养基配方:酪蛋白胨 10 g/L、牛肉浸出 粉 10 g/L、酵母浸粉 5 g/L、葡萄糖 20 g/L、磷酸氢二 钾 2 g/L、柠檬酸氢二铵 2 g/L、三水乙酸钠 8.3 g/L、 七水合硫酸镁 0.58 g/L、一水合硫酸锰 0.25 g/L、吐 温 80 1 mL/L,固体培养基含琼脂粉 2%。

  1.2  方法

  1.2.1  单因素试验优化培养基组分

  保持七水合硫酸镁和一水合硫酸锰的含量不 变,通过控制变量依次对配方中的葡萄糖、酪蛋白 胨、牛肉浸出粉、酵母提取物、三水乙酸钠、柠檬酸氢 二铵、磷酸氢二钾和吐温 80 这些单因素进行筛选, 确定最佳配方以进行响应面优化。

  1.2.2  响应面法优化唾液乳杆菌的培养基组分

  利用 Box-Behnken 试验设计,采用 3 因素 3 水 平进行响应面设计 ,完成最佳培养基配方的优化 (表 1)。

  2  结果与分析

  2.1  单因素试验

  依次对培养基中的碳源、氮源、酵母粉、牛肉浸  出粉、磷酸氢二钾、三水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、吐温 80 等单因素进行筛选试验,以筛选出的最佳添加量 组成培养基的最佳配方,结果如图 1 所示。为了加 快 AR809 的生长速度,并最大程度增加其生长量、 降低生产成本,筛选得出的单因素优化结果为葡萄 糖 20 g/L、酪蛋白胨 10 g/L、牛肉浸出粉 10 g/L、酵 母提取物 7 g/L、三水乙酸钠 6.3 g/L、柠檬酸氢二铵 2 g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、吐温 80 0.5 mL/L。考虑到 这些单因素对 AR809 生长的影响差异,我们选择葡 萄糖、酵母提取物和柠檬酸氢二铵三个因素用于后 续的响应面分析。

  2.2  响应面优化培养基的组成

  2.2.1  试验设计与结果

  根据单因素实验确定葡萄糖、酵母提取物和柠 檬酸氢二铵等因素的水平范围 ,用 Design-Expert 12 软件设计响应面试验,进行 3 因素 3 水平的 17 组实验,实验结果见表 2。

  2.3.2  响应面回归模型的建立与方差分析

  以 OD600(Y)为响应面,以 A、B、C 为自变量,对 Y 进行数据拟合,建立如下多元二次回归数学模型:

  Y=1.451 4+0.015 3A+0.007 4B+0.020 0C+0.0007AB-0.002 2AC-0.032 3BC-0.016 9A2-0.037 8B2-0.068 9C2

  K-式中:Y 为 OD600 值,A、B、C 分别为葡萄糖、 酵母提取物和柠檬酸氢二铵。

  对回归模型进行可信度分析和方差分析,结果 见表 3。模型 F=4.08,P=0.038 5<0.05,表明回归模型 的方差差异性显著。失拟项为 0.426 8,大于 0.05,说 明该模型的失拟项差异性不显著。由此可见,该模 型拟合性较好,建立的回归方程可用于唾液乳杆菌 发酵培养基条件的理论预测。依据回归方程,利用 Design Expert 12 软件绘制响应面图,见图 2。AB、 AC、BC 这三组交互作用都呈现出了相对典型的先 升高后降低的趋势,形状呈椭圆形,表明三者存在一 定的交互作用。回归方程对 AR809 生长的拟合效果 良好,因此可以用该模型进行预测和分析。优化得 出最佳参数条件,即葡萄糖 21.111 9 g/L、酵母提取 物 7.047 5 g/L、柠檬酸氢二铵 2.063 1 g/L,在此条件下预测得到的 OD600 为 1.635。

  3  讨论

  在工业微生物的发酵生产过程中,葡萄糖是所 有碳源中最易利用的,经常被用于培养基的主要碳 源。此外,氮源、生长因子和无机盐也是唾液乳杆菌营 养物质的组成成分。从单因素优化结果来看,AR809 葡萄糖的利用质量浓度为 20 g/L,酵母提取物的质 量浓度为 7 g/L,柠檬酸氢二铵的浓度为 2 g/L。

  与一般单因素实验和正交实验相比,响应面分  析法周期短、试验次数较少,又能够研究多个因子的 交互作用,被广泛应用于指导微生物规模化生产[7]。 本试验从单 因素优化 出发 ,通过 Box-Bohnkon Design 试验设计和响应面分析进一步将单因素优化 到最佳浓度:葡萄糖 21.111 9 g/L,酵母提取物 7.047 5 g/L,柠檬酸氢二铵为 2.063 1 g/L。模型预测的最 高生长量的 OD600 为 1.635。

  本试验通过优化其培养基配方来提高其发酵效 率,为唾液乳杆菌 AR809 的工业化应用奠定了良好 的基础。

  4  结论

  本研究通过单因素实验及响应面优化对唾液乳 杆菌 AR809 的培养基进行优化,确定了最佳发酵培 养基配方。这为接下来对唾液乳杆菌 AR809 进行高 密度培养提供了数据支撑。

  参  考  文  献

  [1] YANG Y, SONG X, XIONG Z, et al. Complete Genome Sequence of Lactobacillus salivarius AR809, a Probiotic Strain with Oropharyngeal Tract Resistance and Adhesion to the Oral Epithelial Cells[J]. Current Microbiology, 2022, 79(9): 1-13.

  [2] PEREZ-CANO J F, DONG H, YAQOOB P. In vitro immunomodulatory activity of Lactobacillus fermentum CECT5716 and Lactobacillus salivarius CECT5713: two probiotic strains isolated from human breast milk[J]. Immunobiology, 2010, 215(12): 996-1004.

  [3] MESSAOUDI S, MADI A, PREVOST H, et al. In vitro evaluation  of  the  probiotic  potential  of  Lactobacillus salivarius SMXD51[J]. Anaerobe, 2012, 18(6): 584-589.

  [4] CHAVES B D, BRASHEARS M M, NIGHTINGALE K K. Applications and safety considerations of Lactobacillus salivarius as a probiotic in animal and human health[J]. Journal of Applied Microbiology, 2017, 123(1): 18-28.

  [5] JIA G, LIU X, CHE N, et al. Human-origin Lactobacillus salivarius AR809 protects against immunosuppression in S. aureus-induced pharyngitis via Akt-mediated NF- κB and autophagy signaling pathways[J]. Food & Function, 2020, 11(1): 270-284.

  [6] JIA G C, CHE N, XIA Y J, et al. Adhesion to pharyngeal epithelium  and  modulation  of  immune  response: Lactobacillus salivarius AR809, a potential probiotic strain isolated from the human oral cavity[J]. Journal of Dairy Science, 2019, 102(8): 6738-6749.

  [7] 杨勇, 张勇, 李书琴, 等. 黄麻链霉菌 AUH-1 抗菌活性 物质发酵优化研究[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(4): 268-274.

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