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胶原蛋白肽对人牙周膜成纤维细胞损伤的保护作用论文

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  关键词:口腔修护;牙周膜成纤维细胞;胶原蛋白肽;炎症因子

  牙周炎是口腔科中的常见病和多发病,在世界范围内有较高的患病率。牙周膜成纤维细胞(PDLFs)作为牙周膜中分布最多、功能最重要的细胞[1],一直是影响牙周炎发病机制、护理预防和修复治疗的重点,调控PDLFs的凋亡及炎症因子的分泌对防治牙周炎病症具有十分重要的意义。

胶原蛋白肽对人牙周膜成纤维细胞损伤的保护作用论文

  胶原蛋白肽(Collagen Peptides,CP)作为一种天然的生物产品和功能性蛋白配料,近年来在食品、化妆品和药品等多个领域的应用发展迅速,但关于其在口腔修护方面的应用研究相对较少。牙周炎的主要致病菌是革兰氏阴性厌氧杆菌,其外膜成分脂多糖(LPS)被认为是破坏牙周的主要毒力因子之一[2]。本研究通过LPS干预诱发炎症反应来建立体外PDLFs炎症模型,并从细胞水平来深入研究胶原蛋白肽(CP)对PDLFs的细胞活力和炎症因子分泌的影响,以期为胶原蛋白肽的临床应用提供可靠的实验依据。

  1实验材料及仪器

  1.1材料

  胶原蛋白肽(Collagen Peptides,CP)来自北京盛美诺生物技术公司。

  1.2仪器和设备

  电泳仪为Bio-RAD;Multiskan MK3酶标仪为Thermo Scientific。

  2实验方法

  2.1 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定细胞活力

  取冻存人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs),复温培养后,取对数生长期细胞,0.25%的胰酶消化后用含10%FBS的DMEM培养基制备成1×105个/mL的细胞悬液,备用。

  取细胞悬液,每孔100μL均匀接种于96孔板中,置于培养箱中培养24 h。按实验分组加入培养基,培养24 h后,每孔内加入10μL的CCK-8,避光反应2 h,酶标仪上测定各孔在450 nm处的吸光值(A)。

  相对增殖率的计算公式如下:

  2.2实验分组

  经CCK-8法筛选,确定LPS质量浓度为10.0μg/mL时,对细胞生长具有较强的抑制作用且无明显的毒性。

  将hPDLFs细胞分为空白对照组、模型组、CP-10组(10 mg/L CP)、CP-50组(50 mg/L CP)、CP-100组(100 mg/L CP)、CP-500组(500 mg/L CP)和CP-1000组(1000 mg/L CP)。其中,空白对照组采用正常的DMEM培养基培养,模型组采用含10μg/mL LPS的DMEM培养基培养,不同质量浓度的CP组采用含10μg/L LPS及相应质量浓度的CP的DMEM培养基培养。

  2.3酶联免疫吸附法检测炎症因子

  取细胞悬液接种于孔板中,加入相应的培养基,培养24 h后收集细胞上清,检测炎症因子。

  2.4 Western Blotting检测蛋白质表达

  取细胞悬液接种于6孔板中,加入相应的培养基,培养24 h后收集细胞,提取总蛋白并定量。随后,进行电泳转膜,分别加入TLR4、NF-κB p65、iNOS和GAPDH蛋白一抗,在4℃条件下孵育过夜,TBST洗涤后,加入二抗室温下孵育1 h,TBST洗涤后使用ECL发光液曝光,观察蛋白条带。

  2.5统计方法

  数据采用SPSS 23.0软件进行统计数据处理,各组实验数据以均数±标准差表示,P<0.05呈显著性差异,具有统计学意义。

  3结果及分析

  3.1 CP对hPDLFs细胞活性的影响

  应用CCK-8法检测不同质量浓度的CP对正常hPDLFs细胞活力的影响。可以看出,在1~5 d内,不同质量浓度的CP对hPDLFs的细胞活力均有一定的促进作用,且时间越长效果越显著。在5组不同质量浓度的实验中,质量浓度为100 mg/L的CP的作用最显著。

  3.2 CP对LPS处理条件下hPDLFs细胞活力的影响

  CP对细胞活力的影响见图1。可以看出,与空白对照组相比,模型组的细胞活力显著降低,说明10μg/L LPS具有显著的抑制作用,CP-10组与模型组的细胞活力相近,CP-50、CP-100、CP-500和CP-1000效果组的细胞活力较模型组显著升高。

  3.3 CP对LPS处理条件下炎症因子分泌的影响

  TNF-α、IL-8、IL-6是参与炎症反应的重要介质,可促进炎性反应进程。CP对炎症因子分泌的影响见图2。可以看出,LPS刺激24 h后,模型组IL-8和TNF-α的分泌量分别是空白对照组的5倍和4倍左右;IL-6的分泌量为空白对照组的1/3左右。这一结果说明,LPS能显著上调hPDLFs中IL-8和TNF-α的分泌量,且显著降低IL-6的分泌量。除CP-10组外,其他实验组中的IL-8和TNF-α含量较模型组均显著降低,IL-6含量均显著升高。

  3.4 CP对LPS处理条件下hPDLFs待测蛋白表达的影响

  CP对待测蛋白的表达情况见图3。

  研究结果显示,与空白对照组相比,模型组中的TLR4和NF-κB p65含量显著增加,而iNOS含量显著降低。实验说明,高于100 mg/L的CP对LPS的毒性具有显著的抵消作用。

  4讨论

  PDLFs作为牙周膜中最主要的细胞,是牙周组织再生和修复损伤的细胞基础。本研究结果显示,100 mg/mL以上质量浓度的胶原蛋白肽(CP)不仅能促进hPDLFs生长,还能降低LPS对hPDLFs的细胞毒性,提升细胞活力和迁移能力。这与刘超等[3]的研究结果一致,说明CP具有潜在的口腔修护功效。此外,推测CP具有信号分子的作用,能加速PDLFs的代谢活动,从而提高细胞活力和迁移能力。

  脂多糖(LPS)是细菌表面最重要的致病因子,能刺激多种类型的细胞分泌细胞因子。本研究利用LPS刺激hPDLFs,模拟建立了体外牙周炎感染模型。研究发现,10μg/mL LPS会诱导hPDLFs增加IL-8和TNF-α的分泌,但会减少IL-6的分泌。IL-6和TNF-α都属于促炎因子,其中IL-6是由LPS诱导产生的重要炎症因子之一,能产生复杂的促炎和抗炎双向作用。有研究表明[4],成纤维细胞可以自发产生IL-6,LPS可通过抑制IL-6细胞因子的表达来逃避宿主的免疫防御机制。本实验结果显示,正常的hPDLFs同样会自发分泌少量的IL-6由此,可推测IL-6是作为一种基础防御因子而存在于hPDLFs内的,而LPS会降低IL-6的分泌,从而有助于LPS在更长时间内存在。

  TNF-α作为炎症细胞因子可促进IL-1、IL-6、IL-8等的表达。本研究中,较空白对照组而言,模型组中TNF-α的蛋白表达水平显著增加,添加CP后,TNF-α显著降低,表明CP能通过减少TNF-α的产生而减弱炎症反应。IL-8是导致牙周炎症的另一种重要的促炎因子和免疫调节因子。本研究结果显示,100 mg/mL以上质量浓度的CP能显著减少LPS诱导hPDLFs产生的IL-8。

  TLR4是细胞识别LPS的重要分子,LPS能够通过刺激TLR4表达发挥毒性作用。NF-κB是炎症反应中重要的信号通路,可调控多种炎症因子的转录与表达。本研究表明,LPS会促进hPDLFs中TLR4和NF-κB p56的表达水平,而100 mg/mL以上的CP能显著降低两者的表达,说明CP对LPS诱导产生的hPDLFs细胞炎症有一定保护的作用。其作用机制可能是该成分参与调控TLR4/NF-κB通路,抑制下游炎性细胞因子TNF-α和IL-8的表达,以起到保护hPDLFs的作用。

  有效的口腔护理能够预防或降低牙周炎等口腔炎症的发生。然而,目前的口腔护理仍以药物治疗方式为主,而药物虽能够有效控制炎症,但长期使用会引发严重的不良反应。因此,迫切需要探索低毒甚至无毒的抗炎成分。本研究显示,胶原蛋白肽(CP)可减弱LPS诱导下hPDLFs细胞活力,抑制炎症反应,为其在牙周疾病的预防和治疗中的应用提供了有力的证据。

  参考文献

  [1]SOKOS D,EVERTS V,VRIES T J.Role of periodontal ligament fibroblasts in osteoclastogenesis:a review[J].Journal of periodontal research,2015,50(2):152-159.

  [2]Nemoto E,Darveau R,Foster B,et al.Regulation of Cementoblast Function by P.gingivalis Lipopolysaccharide via TLR2[J].Journal of Dental Research,2006,85(8):733-738.

  [3]刘超,孙皎.水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的效应[J].口腔材料器械杂志,2017,26(2):74-78.

  [4]滕嘉硕,李梦思,罗远良,等.心脏成纤维细胞释放的IL-6在阿霉素致SD乳鼠心肌细胞损伤中的作用研究[J].中国病理生理杂志,2021,37(6):1004-1010.

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